RNA修飾在生命過(guò)程和疾病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到重視，其中5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾是熱門(mén)研究領(lǐng)域。本文聚焦于m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2在肝癌中的作用，NSUN2通過(guò)M5C修飾穩(wěn)定PKM2 mRNA促進(jìn)肝癌糖酵解和進(jìn)展。

m5C修飾是指在RNA分子中，通過(guò)特定的酶將胞嘧啶（C）的第5位碳原子上加上一個(gè)甲基基團(tuán)，形成5-甲基胞嘧啶。這種修飾不會(huì)改變RNA的基本核苷酸序列，但會(huì)在不改變遺傳信息編碼的基礎(chǔ)上，賦予RNA新的化學(xué)和生物學(xué)特性。m5C修飾主要由NSUN（NOL1/NOP2/SUN）家族的甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成，涉及mRNA穩(wěn)定性與翻譯調(diào)控、tRNA 穩(wěn)定性與解碼功能、rRNA加工與核糖體功能和非編碼RNA功能調(diào)節(jié)，廣泛地參與到各種生命活動(dòng)的調(diào)控中。

研究背景：

肝癌（HCC）是常見(jiàn)癌癥及癌癥死亡主要原因，術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)致患者5年生存率低。RNA 的5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾在多種癌癥中發(fā)揮作用，NSUN2是m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，但它在肝癌中的臨床意義、作用機(jī)制等尚不明確。

研究方法：

臨床樣本采集與分組：收集125對(duì)肝癌（HCC）及相應(yīng)癌旁組織（ANL），用于RT-qPCR、western blot及IHC分析NSUN2表達(dá)分布與患者臨床特征的相關(guān)性，并進(jìn)行mRNA m5C斑點(diǎn)印跡和m5C-RIP-seq測(cè)序。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：主要檢測(cè)多株肝癌細(xì)胞株的及增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞行為學(xué)改變。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用5周齡雄性BALB/c裸鼠，在其雙側(cè)腋窩皮下接種HCC細(xì)胞建立皮下異種移植模型，定期測(cè)量腫瘤體積；通過(guò)尾靜脈注射HCC細(xì)胞建立肺轉(zhuǎn)移模型，用活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移過(guò)程。

其他：RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、放線菌素D實(shí)驗(yàn)、代謝測(cè)量實(shí)驗(yàn)等；

主要研究結(jié)果：

（1）NSUN2在HCC組織中的表達(dá)上調(diào)；

通過(guò)對(duì)125對(duì)HCC和癌旁組織（ANL）的研究，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）和免疫組化（IHC）分析，結(jié)果顯示HCC組織中NSUN2的蛋白水平顯著高于ANL組織。Kaplan-Meier 生存分析，結(jié)果顯示NSUN2高表達(dá)患者的總生存期（OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）明顯低于NSUN2低表達(dá)患者。此外，對(duì)80例HCC患者的臨床病理特征與NSUN2表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NSUN2高表達(dá)與腫瘤大小、微血管侵犯（MVI）、TNM分期和BCLC分期顯著相關(guān)。腫瘤越大、存在微血管侵犯、TNM分期和BCLC分期越晚，NSUN2的表達(dá)越高。

圖1. HCC組織中NSUN2高表達(dá)并與HCC不良預(yù)后有關(guān)。

（2）體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NSUN2 對(duì)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響

運(yùn)用慢病毒分別在HepG2和SNU387細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NSUN2，在Hep3B和Huh7細(xì)胞中穩(wěn)定沉默NSUN2。過(guò)表達(dá)NSUN2能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移，而沉默NSUN2則抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NSUN2過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)并增加肝癌肺轉(zhuǎn)移，而NSUN2沉默則抑制皮下瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。

圖2. NSUN2在體內(nèi)外誘導(dǎo)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

（3）NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在肝癌HCC中的作用

對(duì)5對(duì)HCC和癌旁正常肝組織進(jìn)行m5C dot blotting，結(jié)果顯示HCC組織中總mRNA m5C 水平高于ANL組織；m5C-RIP-seq分析顯示HCC和癌旁正常肝組織m5C修飾存在差異，聯(lián)合分析mRNA m5C-RIP-seq和 mRNA-Seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)HCC中mRNA表達(dá)與m5C水平呈輕度正相關(guān)；KEGG通路分析顯示，表達(dá)和m5C水平均上調(diào)的mRNA主要富集在10條信號(hào)通路中，其中癌癥中的中心碳代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝等與代謝相關(guān)。

圖3. NSUN2介導(dǎo)的m5C高甲基化促進(jìn)肝細(xì)胞癌的代謝轉(zhuǎn)變。

（4）PKM2是NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾的主要靶標(biāo)

對(duì)Hep3B-NSUN2-sh2細(xì)胞及其陰性對(duì)照進(jìn)行mRNA測(cè)序，結(jié)果顯示敲低NSUN2后，236個(gè)基因上調(diào)，376個(gè)基因下調(diào)。將HCC中表達(dá)上調(diào)的mRNA、m5C 水平上調(diào)的mRNA以及 Hep3B細(xì)胞中敲低NSUN2后表達(dá)下調(diào)的mRNA進(jìn)行重疊分析，通過(guò)維恩圖篩選出11個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的mRNA（B3GNT3、CD7、EML2、FOXC1、GDF15、LRP4、MAPT、MCTP1、PKM2、PODXL 和 SLC1A7）。檢測(cè)這11個(gè)mRNA在40對(duì)HCC和癌旁正常肝組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)在HCC中上調(diào)。進(jìn)一步檢測(cè)這7個(gè)mRNA在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在HepG2和SNU387細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NSUN2后，只有PKM2的表達(dá)上調(diào)；在Hep3B 和Huh7細(xì)胞中沉默NSUN2后，PKM2的表達(dá)下調(diào)。此外，根據(jù)m5C-RIP-seq結(jié)果，PKM2 mRNA上調(diào)的m5C峰位于其3′ - UTR（chr15:72491753 - 72491855，hg19）。通過(guò)針對(duì)該峰的m5C-RIP-qPCR驗(yàn)證了這一結(jié)果，進(jìn)一步表明PKM2 mRNA是NSUN2作用的主要靶標(biāo)。

圖4. PKM2 mRNA是NSUN2作用的靶標(biāo)。

（5）NSUN2通過(guò)增加m5C水平穩(wěn)定PKM2 mRNA

通過(guò)放線菌素D處理HCC細(xì)胞，并在不同時(shí)間點(diǎn)利用RT-qPCR分析PKM2 mRNA水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NSUN2會(huì)減緩PKM2 mRNA的降解，而沉默NSUN2則加速其降解。m5C-RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)SNU387細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NSUN2后，PKM2 mRNA m5C水平升高；在 Hep3B細(xì)胞中沉默NSUN2后，其m5C水平降低；隨后，使用針對(duì)PKM2的m5C峰的引物和經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板進(jìn)行亞硫酸氫鹽PCR，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在chr15:72491773（hg19）位點(diǎn)（C773）的信號(hào)中，既有胞嘧啶（‘C’）又有胸腺嘧啶（‘T’），這表明該位點(diǎn)在HCC組織和細(xì)胞系中均發(fā)生了m5C 甲基化。通過(guò)計(jì)算各樣本中C773位點(diǎn)的m5C水平，發(fā)現(xiàn)HCC組織中的m5C水平高于癌旁正常肝組織。同時(shí)，SNU387細(xì)胞過(guò)表達(dá) NSUN2后該位點(diǎn)m5C水平上升，Hep3B細(xì)胞沉默NSUN2后該位點(diǎn)m5C水平則下降。最后，構(gòu)建含有野生型3′-UTR的PKM2 mRNA（PKM2-WT）和突變型 C773（PKM2-Mut）的質(zhì)粒進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)NSUN2可增加 PKM2-WT的熒光素酶活性，對(duì)PKM2-Mut則無(wú)此作用；沉默NSUN2的效果則相反表明 NSUN2 對(duì)PKM2的調(diào)控作用依賴(lài)于m5C位點(diǎn)C773。

圖5. NSUN2通過(guò)增加m5C水平穩(wěn)定PKM2 mRNA。

（6）NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC的糖酵解和進(jìn)展

通過(guò)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲低NSUN2后HCC細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成、細(xì)胞外酸化率（ECAR）和糖酵解質(zhì)子外流率（glycoPER）來(lái)評(píng)估糖代謝變化。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NSUN2顯著增加了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，敲低NSUN2則降低了這些指標(biāo)，表明 NSUN2 促進(jìn)HCC細(xì)胞的糖酵解。

圖6. NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC的糖酵解和進(jìn)展。

隨后，使用siRNA靶向PKM2，發(fā)現(xiàn)其可下調(diào)PKM2四聚體、二聚體和單體的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)NSUN2可減緩這種下調(diào)作用。敲低PKM2抑制了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，而過(guò)表達(dá)NSUN2可部分阻斷這些抑制作用，表明NSUN2 對(duì)HCC糖酵解的促進(jìn)作用部分通過(guò)上調(diào)PKM2實(shí)現(xiàn)。最后，檢測(cè)了PKM2對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響及NSUN2的作用，發(fā)現(xiàn)敲低PKM2抑制了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，而過(guò)表達(dá)NSUN2可阻斷這種抑制作用，說(shuō)明NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。

（7）研究示意圖

直觀地展示從NSUN2表達(dá)上調(diào)，到PKM2 mRNA穩(wěn)定、PKM2蛋白增加，再到促進(jìn)HCC糖酵解、細(xì)胞增殖和遷移的一系列過(guò)程，為理解HCC的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為后續(xù)研究潛在的治療靶點(diǎn)提供了方向。

圖7. NSUN2介導(dǎo)PKM2在HCC中的m5C調(diào)節(jié)機(jī)制示意圖。

研究總結(jié)：

肝癌中NSUN2表達(dá)上調(diào)且與預(yù)后不良相關(guān)；NSUN2通過(guò)增加PKM2 mRNA的m5C修飾穩(wěn)定其表達(dá)，促進(jìn)糖酵解，進(jìn)而推動(dòng)肝癌進(jìn)展，研究明確PKM2是NSUN2介導(dǎo)m5C修飾的靶基因，揭示NSUN2促進(jìn)肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。綜合多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞、動(dòng)物模型及臨床樣本驗(yàn)證，NSUN2可作肝癌預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，為肝癌臨床診療提供新思路。

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參考文獻(xiàn)

Qi Q, Zhong R, Huang Y, Tang Y, Zhang XW, Liu C, Gao CF, Zhou L, Yu J, Wu LY. The RNA M5C methyltransferase NSUN2 promotes progression of hepatocellular carcinoma by enhancing PKM2-mediated glycolysis. Cell Death Dis. 2025 Feb 9;16(1):82. doi: 10.1038/s41419-025-07414-5. PMID: 39924557; PMCID: PMC11808121.